造血干細胞是最早發(fā)現(xiàn)和鑒定的干細胞，是研究干細胞生物學功能及其調(diào)節(jié)的范式。也是研究各種疾病病理生理機制及預防治療措施的重要模型。競爭性骨髓移植模型在造血干細胞功能研究及骨髓移植相關問題研究中應用廣泛。

移植過程中，應注意一些實驗細節(jié)。移植前受體小鼠的清髓一般選擇致死劑量照射，C57BL/6J背景小鼠一般照射總劑量為9.0 Gy，可分2次照射，每次照射劑量為4.5 Gy，中間間隔2 h。照射后2 h 左右進行群體細胞注射，其移植成功效率更高。一般選擇2.5 × 105受體同源的全骨髓細胞作為保護細胞，保護細胞數(shù)量過多會降低供體來源細胞的檢出效率，過少則無法保證致死劑量照射小鼠短期的存活。

在制備模型過程中，使用的輻照儀是自屏蔽的。使用時有自動安全保護設置，周圍環(huán)境是安全的。

在骨髓移植后1個月、3個月分別采血，應用流式細胞儀分析外周血中供體細胞嵌合率：在EP管中加入抗凝劑0.1M EDTA 10ul，從眼后靜脈叢取血30ul，標記抗體，使用staining medium調(diào)整染色體積50ul，冰上孵育30min。（4色以上，同時配備單一抗體染色對照管）。每管加入1ml BD Pharm Lyse裂解紅細胞，室溫孵育5-10min，1500rpm/min 離心5min。棄上清，加入1ml staining medium洗一遍；200ul重懸，上機檢測不同分型造血免疫細胞中45.1和45.2細胞的比例。

模型評價方法：在移植后1個月、2個月（或者3個月）采集外周血，流式方法檢測供體造血細胞的嵌合率。1個月時嵌合率在70~80%；2~3個月時嵌合率是40~50%。

1.實驗動物雄性 C57BL/6J-Ly-5.1 (Ly5.1) 小鼠購自實驗動物科學研究所（PUMC，北京，中國）；C57BL/6J J（Ly5.2）小鼠購自Vital River（中國北京）。小鼠 8-12 周齡，體重 20-25 克。

2.試劑流式檢測用抗體均是eBioscience產(chǎn)品。

3.動物模型建立方法

3.1移植前準備：小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房內(nèi)，墊料高溫消毒，隔日更換，飼料經(jīng)60Co照射滅菌，飲水為過濾的無菌水；

3.2全身照射：C57BL/6J-Ly-5.2受體小鼠在接受骨髓移植前接受致死劑量的放射線照射。采用X或γ射線做全身照射，劑量率0.5-1Gy/min，總劑量9Gy（亦可分兩次照射，每次劑量4.5Gy，間隔時間2~5小時，以減少放射線對器官的損傷）；

3.3供體小鼠骨髓細胞的分離：從C57BL/6J-Ly-5.1小鼠骨骼中沖出骨髓有核細胞作為供體細胞，將細胞濃度調(diào)至2×107個/ml；

3.4制備植入細胞混合液：將從C57BL/6J-Ly-5.1小鼠中收集的細胞與同樣方法收集的C57BL/6J-Ly-5.2小鼠按1：1混合；

3.5移植：將制備的植入細胞混合液通過眼后靜脈叢或尾靜脈注射注入全身照射處理后的C57BL/6J-Ly-5.2受體小鼠，每只受體小鼠接受注射液體總量控制在200-300μl。含單個核骨髓細胞約1×106個；

3.6移植后受體給予抗生素一周。飲水中添加乳酸左氧氟沙星0.5mg/ml，建議藥物使用注射液劑型，以避免藥物阻塞飲水口。移植后注意飲食飲水補給，以提高移植成活率。

1、造模因素信息

本模型受體小鼠須接受致死劑量電離輻射。

電離輻射是指攜帶足以使物質原子或分子中的電子成為自由態(tài)，從而使這些原子或分子發(fā)生電離現(xiàn)象的能量的輻射。電離輻射的特點是波長短、頻率高、能量高。電離輻射可以從原子、分子或其他束縛狀態(tài)中放出（ionize）一個或幾個電子。電離輻射是一切能引起物質電離的輻射的總稱，其種類很多，高速帶電有α粒子、β粒子、質子，不帶電粒子有中子以及X射線、γ射線。本實驗中使用的小動物專用的X射線、γ射線照射設備。

2、實驗動物背景信息

C57BL/6J小鼠，攜帶CD45.1和CD45.2等位基因。分別作為供體小鼠和受體小鼠。

3、研究背景

1961年加拿大科學家James Till和ErnestMcCulloch在為收到射線照射后小鼠輸注骨髓細胞后發(fā)現(xiàn)了小鼠脾結節(jié)，提出了造血干細胞的基本特征，奠定了造血干細胞生物學的基礎。此后各國科學家為分離純化造血干細胞以及檢測造血干細胞功能及調(diào)節(jié)機制，研究造血干細胞移植相關臨床問題進行了廣泛的研究。骨髓移植實驗成為檢測造血干細胞自我更新和分化的能力的金標準。攜帶CD45.1和CD45.2等位基因的C57BL/6J小鼠培育成功為廣泛應用競爭性骨髓移植實驗提供了物質基礎。

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