腹腔注射中等劑量（7.5 mg/次，3 次/周，共 4 周）右旋糖酐鐵溶液可成功構(gòu)建外源性鐵過載小鼠模型，通過尾靜脈注射 Mtb 可構(gòu)建活動(dòng)性結(jié)核病鐵過載小鼠模型。模型評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)是鐵過載小鼠外周血血清鐵和鐵蛋白水平，以及各臟器組織 HE與普魯士藍(lán)染色來確證。鐵過載的結(jié)核動(dòng)物模型主要通過組織荷菌量和病變來綜合評(píng)價(jià)。

本模型中鐵過載模型參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法，而鐵過載的小鼠結(jié)核模型采用本研究室結(jié)核模型制備方法，目前未見報(bào)道。

該模型模擬臨床上先天性代謝障礙導(dǎo)致體內(nèi)鐵過度蓄積；同時(shí)，持續(xù)性大量輸血、長(zhǎng)期內(nèi)服鐵劑或某些血液性疾病均可導(dǎo)致機(jī)體鐵負(fù)荷過載患者，可用于研究鐵過載對(duì)機(jī)體抗結(jié)核免疫應(yīng)答損傷機(jī)制，以及鐵過載如何促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi) Mtb 的生長(zhǎng)及其在 TB 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。

動(dòng)物模型的制備的設(shè)計(jì)得到研究所IACUC委員會(huì)的批準(zhǔn)，人員都是訓(xùn)練有素的研究人員和實(shí)驗(yàn)人員，全程在ABSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，完全按照模型制備和檢測(cè)的一系列SOP操作進(jìn)行，遵守生物安全操作要求，無安全事故。

1、 表型分析

1.1 鐵過載小鼠組織形態(tài)及體重評(píng)估

鐵過載小鼠外觀與正常小鼠無明顯區(qū)別，自主活動(dòng)穩(wěn)定，精神狀態(tài)平穩(wěn)。解剖后正常小鼠各臟器組織表面光滑，無充血、水腫。鐵過載小鼠肝臟顏色呈暗褐色，且隨著右旋糖酐鐵劑量增加而逐漸加深，其他臟器組織無明顯顏色及形態(tài) 變化（圖 1）。低劑量組、中劑量組與陰性對(duì)照組相比體重增長(zhǎng)無顯著差異。高劑量組體重增長(zhǎng)略有減緩，且與其他劑量實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組比較差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 圖 2，P ＜ 0.05)。

圖 1. 不同劑量鐵過載小鼠肝臟變化

圖 2. 不同劑量鐵過載小鼠體重增長(zhǎng)百分比

*表示高劑量組與低劑量組、中劑量組及陰性對(duì)照組比較，P ＜0.05。

2.2 鐵過載小鼠組織鐵含量變化

鐵過載小鼠中肝組織含鐵量最高，與陰性對(duì)照組小鼠相比增加接近 7 倍。其次，組織鐵含量由高至低依次為脾臟，腎臟及小腸。高劑量組和中劑量組各臟器組織鐵含量均顯著高于陰性對(duì)照組（圖 3，P 均 ＜ 0.05），低劑量組小鼠心臟和肺組織鐵含量顯著低于其他劑量組，與陰性對(duì)照組相比無顯著性差異（圖 3， P ＞ 0.05）。

圖 3. 不同劑量鐵過載小鼠組織含鐵量

*表示各不同劑量組與陰性對(duì)照組比較，P ＜0.05；**表示各不同劑量組與陰性對(duì)照組比較，P ＜0.01。

2.3 鐵過載血生化指標(biāo)變化

鐵過載小鼠分別于鐵劑注射 4 周后取外周血血清進(jìn)行血清鐵、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體檢測(cè)，結(jié)果如圖 4 所示。陰性對(duì)照組和各不同劑量鐵劑組小鼠血清鐵水平分別為19.95 ± 5.64 μmol/L、43.00 ± 6.82 μmol/L、65.84 ± 167 9.31 μmol/L 和 108.45 ± 9.90 μmol/L，組間差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (圖 4，P 均 ＜ 0.05) 。進(jìn)一步檢測(cè)各組動(dòng)物外周血鐵蛋白水平分別為 773.82 ± 161.51 μg/L、 169 1063.68 ± 65.15 μg/L、1344.08 ± 168.57 μg/L 和 1694.73 ± 44.45 μg/L，組間差異同樣有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 圖 4，P 均 ＜ 0.05) 。然而，各劑量組小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白和可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體水平與正常對(duì)照組小鼠相比均無顯著差異（圖 4，P ＞ 0.05）。

圖 4. 不同劑量鐵過載小鼠血清鐵、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體水平

(a)：血清鐵，(b)：血清鐵蛋白，(c)：血清轉(zhuǎn)鐵蛋白，(d)：血清可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。*表示各不同劑量組與陰性 對(duì)照組比較，P ＜0.05；**表示各不同劑量組與陰性對(duì)照組比較，P ＜0.01。

3、病理表型

鐵過載小鼠組織HE 染色與鐵染色鐵過載模型中高劑量組小鼠肝臟、脾臟和腎臟組織HE 染色均可見大量團(tuán)狀含鐵血黃素沉積。肝細(xì)胞核固縮、溶解，胞漿內(nèi)滿布蛋白微粒；脾小體與紅髓區(qū)界限不清；小腸及心臟組織可見部分含鐵血黃素沉積，心肌纖維出現(xiàn)排列異常，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，充血水腫、出血等病理變化；肺部可見小數(shù)鐵蛋白微粒，支氣管和血管周圍及其管腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞滲出，并可見肺泡不均勻擴(kuò)張，肺泡間隔斷裂等。中劑量組和低劑量組僅肝臟和脾臟可見含鐵血 黃素沉，且含鐵血黃素沉程度與鐵劑量成正相關(guān)；心臟、肺、腎臟及小腸等組織未見明顯含鐵血黃素沉積及炎性細(xì)胞浸入，與陰性對(duì)照組相比無明顯變化（圖6）。普魯士藍(lán)染色與組織鐵含量測(cè)定結(jié)果一致，陰性對(duì)照組小鼠各組織鐵染色為陰性，高劑量組小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和小腸等組織大量胞外鐵和胞內(nèi)鐵呈顆粒狀、塊狀亮藍(lán)色鐵沉積。中劑量組肝臟和脾臟組織鐵沉積較明顯， 心臟、肺、腎臟和小腸僅可見小量鐵沉積，均未見組織形態(tài)改變。低劑量組小鼠中心臟和肺組織則未見明顯鐵沉積，與陰性對(duì)照組相比無顯著改變（圖 7）。

圖 6. 不同劑量鐵過載小鼠組織 HE 染色（× 20）

圖 7 不同劑量鐵過載小鼠各組織普魯士藍(lán)染色（× 20）

圖 7. 結(jié)核感染鐵過載小鼠肺脾肝組織病理變化（× 20）

4.鐵過載結(jié)核病小鼠組織荷菌量

對(duì)中劑量右旋糖酐鐵建立的鐵過載小鼠模型進(jìn)行 Mtb 感染試驗(yàn)，感染后 4 周解剖并進(jìn)行肺、脾和肝臟病理分析和荷菌量檢測(cè)，結(jié)果表明鐵過載結(jié)核病小鼠構(gòu)建成功。如圖 7 所示，肺脾及肝組織病理 HE 染色中鐵過載 Mtb 感染組肺組織出現(xiàn)多處炎癥反應(yīng)，呈實(shí)變趨勢(shì)，其中肺泡壁增厚，肺泡腔被淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞填充。結(jié)核性肉芽腫顯著增加且多于空白 Mtb 感染組。脾臟白髓被結(jié)核肉芽腫病變破壞，可見炎癥細(xì)胞聚集，且病變較重。同樣，鐵過載 Mtb 感染小鼠肝臟可見水腫、淤血，光鏡下肝細(xì)胞內(nèi)可見團(tuán)塊狀鐵褐色沉積，Mtb 感染后出現(xiàn)多個(gè)散在小肉芽腫樣病變。同時(shí)，感染小鼠肺、脾臟和肝組織荷菌量比較發(fā)現(xiàn)，鐵過載 Mtb 感染組荷菌量比空白 Mtb 感染組各靶器官較高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖 8，P 均 ＜ 0.05）。

圖 8 結(jié)核感染鐵過載小鼠肺脾肝組織荷菌量分析

1.1實(shí)驗(yàn)材料

C57BL/6N 小鼠（北京維通利華，SCXK (京)-2016-0006），右旋糖酐鐵注射液（江西創(chuàng)導(dǎo)動(dòng)物保健品有限公司），血清鐵、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白及可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體檢測(cè)試劑盒（酶免公司），組織鐵檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），普魯士藍(lán)染色試劑盒（Solarbio），結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)株 H37Rv（菌號(hào)為 93009，本室保存），中性羅氏培養(yǎng)管（珠海貝索生物），BACTEC MGIT 7H9 98 分支桿菌快速培養(yǎng)管（BD 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鐵過載小鼠模型建立

6~8 周齡 SPF 級(jí)雌性 C57BL/6N 小鼠隨機(jī)分成陰性對(duì)照、低劑量、中劑量和高劑量 4 個(gè)小組，實(shí)驗(yàn)組分別腹腔注射右旋糖酐鐵3.75、7.5、15 mg/次，陰性對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，3 次/周，共計(jì) 4 周。定期觀察小鼠生長(zhǎng)及精神狀態(tài)，稱重并記錄。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)本所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)（IACUC）批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為：ZLJ2019001。

1.2.2 血清生化指標(biāo)與組織鐵含量測(cè)定

建模完成后將小鼠摘眼球采血，4 ℃凝結(jié)過夜，2000 g 4 ℃離心 10 min，分離小鼠血清并檢測(cè)血清鐵、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白及可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體含量。解剖取小鼠心臟，肝臟、脾臟、肺、腎臟及小腸等組織器官，稱重后加 1ml 生理鹽水充分研磨并裂解組織碎片，12000 g4 ℃離心 20 min，取上清并測(cè)定蛋白濃度。血清生化檢測(cè)按試劑盒說明書進(jìn)行，組織鐵測(cè)定則按試劑盒測(cè)定方法計(jì)算相同蛋白濃度下各組織鐵含量。

1.2.3 鐵過載小鼠 Mtb 感染

SPF 級(jí) C57BL/6N 隨機(jī)分成空白對(duì)照組、空白 Mtb 感染組、中劑量鐵過載模型組和中劑量鐵過載模型 Mtb 感染組，每組 6 只。其中 Mtb 感染組小鼠經(jīng)尾靜脈注射對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 H37Rv 單細(xì)胞菌懸液 100 μl（1×10 6 CFU/ml），空白對(duì)照組注射等劑量無菌生理鹽水。本所 ABSL-3 實(shí)驗(yàn)室（國(guó)衛(wèi) ABSL3-059）正常飼喂， 觀察并記錄小鼠臨床表現(xiàn)，感染后 4 周解剖小鼠。

1.2.4 小鼠組織荷菌量測(cè)定

ABSL-3 實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物解刨臺(tái)中解剖感染小鼠，無菌取小鼠肺、脾和肝臟組織；拍照記錄肺、脾和肝臟等器官大體病變情況，取小鼠左肺、脾頭及肝小葉于生物安全柜內(nèi)稱重，依次經(jīng) 2%稀硫酸溶液、生理鹽水漂洗 30 s，1 ml 生理鹽水溫和勻漿后進(jìn)行 10倍倍比稀釋，分別取 10-3，10-4和 10 -5 稀釋液 50 μl 均勻涂布于中性羅氏培養(yǎng)管內(nèi)，37℃培養(yǎng) 4 周，計(jì)算相應(yīng)的組織器官荷菌量。另取 10 -1稀釋液 500 μl 接種于 BD BACTEC MGIT 960 培養(yǎng)系統(tǒng)，通過記錄報(bào)陽時(shí)間進(jìn)行結(jié)核菌的快速檢測(cè)。

1.2.5 組織切片

HE染色與鐵染色 小鼠各組織器官，10%中性福爾馬林溶液固定 48 h。組織按長(zhǎng)軸最大橫切面修塊、梯度乙醇脫水、石蠟包埋并切成 5 μm 厚度切片，HE 染色后掃描載玻片并保存為 NanoZoomer 數(shù)字病理圖像，不同視野下拍照并進(jìn)行組織病理學(xué)分析。鐵染色組織切片脫蠟至水，切片入 Perls 染液浸染 20 min，蒸餾水充分沖洗切片5 min，入核固紅染色液，淡染細(xì)胞核 10 min，自來水沖洗 5 s。常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固，晾干后拍照觀察其病理形態(tài)改變及鐵沉積程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS16.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。不同實(shí)驗(yàn)處理組之間差異比較采用單因素方差分析，P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。柱形圖采用 GraphPad Prism 5 軟件制作。

一、疾病概述

結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌（結(jié)核菌）引起的一種慢性傳染性疾病，結(jié)核感染通常會(huì)累及肺、淋巴系統(tǒng)及其它多組織器官。除少數(shù)發(fā)病急促外，臨床上多呈慢性過程。常有低熱、乏力等全身癥狀和咳嗽、咯血等呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)。感染后潛伏期4～8周，其中80%發(fā)生在肺部，其他部位（頸淋巴、腦膜、腹膜、腸、皮膚、骨骼）也可繼發(fā)感染。

排菌的肺結(jié)核患者是傳染源,人與人之間呼吸道傳播是本病傳染的主要方式。大多數(shù)的受感染者沒有病癥，稱為潛伏結(jié)核感（latentTBinfection），但其中約5-10%的潛伏感染者會(huì)發(fā)展至活動(dòng)性結(jié)核；若無適當(dāng)治療，一個(gè)活動(dòng)病例平均每年可使10～15人新受感染，病例本人的死亡率則超過50%。若潛伏感染者同時(shí)罹患免疫抑制，如艾滋病，每年就有10%的病發(fā)機(jī)率。

肺結(jié)核病程較復(fù)雜，臨床分型有：1、原發(fā)型肺結(jié)核(Ⅰ型): 肺內(nèi)滲出病變、淋巴管炎和肺門淋巴結(jié)腫大的啞鈴狀改變的原發(fā)綜合征。兒童多見，僅表現(xiàn)為肺門和縱隔淋巴結(jié)腫大。 2、血型播散型肺結(jié)核(Ⅱ型):包括急性血型播散型肺結(jié)核及亞急性、慢性血型播散型肺結(jié)核。 3、繼發(fā)型肺結(jié)核(Ⅲ型):可以出現(xiàn)以增殖為主、浸潤(rùn)為主、干酪病變?yōu)橹骰蛞钥斩礊橹鞯榷喾N病理改變。

結(jié)核菌進(jìn)入機(jī)體后，被巨噬細(xì)胞吞噬，結(jié)核菌毒力與宿主免疫力的抗衡決定著結(jié)核發(fā)病、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。結(jié)核病從感染、發(fā)病到轉(zhuǎn)歸均與多數(shù)細(xì)菌性疾病有顯著不同，宿主反應(yīng)具有特殊意義，反應(yīng)分為4期：1.起始期，入侵呼吸道的結(jié)核菌被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬。因菌量、毒力和巨噬細(xì)胞非特異性殺菌能力的不同，被吞噬結(jié)核菌的命運(yùn)各異。2.T細(xì)胞反應(yīng)期，由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫（CMI）和遲發(fā)性過敏反應(yīng)（DTH）在此期形成，從而對(duì)結(jié)核病發(fā)病、演變及轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生決定性影響。3.共生期，大部分感染者結(jié)核菌可以持續(xù)存活，細(xì)菌與宿主處于共生狀態(tài)。纖維包裹的壞死灶干酪樣中央部位被認(rèn)為是結(jié)核桿菌持續(xù)存在的主要場(chǎng)所。低氧、低PH和抑制性脂肪酸的存在使細(xì)菌不能增殖。宿主的免疫機(jī)制亦是抑制細(xì)菌增殖的重要因素，倘若免疫損害便可引起受抑制結(jié)核菌的重新活動(dòng)和增殖。4.細(xì)胞外增殖和傳播期，固體干酪灶中包含具有生長(zhǎng)能力、但不繁殖的結(jié)核菌。干酪灶一旦液化便給細(xì)菌增殖提供了理想環(huán)境。即使免疫功能健全的宿主，從液化干酪灶釋放的大量結(jié)核桿菌亦足以突破局部免疫防御機(jī)制，引起播散。

結(jié)核病的全身癥狀是全身乏力、午后低熱、盜汗、食欲不振、消瘦等；呼吸道癥狀是咳嗽、咳痰、咯血、胸疼、呼吸困難等。其特征性病理改變是肉芽腫病變和結(jié)核性結(jié)節(jié)，其基本病理變化為滲出性病變、增生性病變和壞死性病變。滲出性病變以炎癥細(xì)胞、單核細(xì)胞肌纖維蛋白為主要成分，增殖性改變以結(jié)核結(jié)節(jié)及結(jié)合性肉芽腫為主，壞死的特征性改變?yōu)楦衫覙痈淖儭＝Y(jié)核性炎癥的主要特是上皮樣細(xì)胞結(jié)節(jié)及郎格漢斯細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)室痰培養(yǎng)為菌陽性，抗酸染色可見細(xì)長(zhǎng)略彎曲的桿菌，血沉加快。肺的原發(fā)病灶、淋巴管炎和肺門淋巴結(jié)結(jié)核合稱為原發(fā)綜合癥，X線影像學(xué)上的典型表現(xiàn)為啞鈴狀陰影。感染3-8周后結(jié)核菌素皮試轉(zhuǎn)陽，95%的健康感染者原發(fā)綜合征自然消退，成為潛伏感染人群，約5%在日后因潛在感染復(fù)燃而發(fā)病,結(jié)核病起病緩慢，病程較長(zhǎng)。

二、模型背景

1、外源鐵及菌株信息

鐵過載模型的外源鐵為右旋糖酐鐵注射液（江西創(chuàng)導(dǎo)動(dòng)物保健品有限公司）；結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)株 H37Rv（菌號(hào) 97 為 93009，本室保存）

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

6~8 周齡 SPF 級(jí)雌性 C57BL/6N 小鼠

3、研究背景

鐵是人體必需的微量元素之一，廣泛分布在全身各種組織器官，對(duì)維持人體的各種生理功能和新陳代謝起重要作用。電子傳遞、細(xì)胞呼吸、細(xì)胞增殖與分化等過程中均需要鐵的參與[1]。同時(shí)，鐵也是病原體毒力和生長(zhǎng)的必需微量營(yíng)養(yǎng)素。臨床 研 究 發(fā)現(xiàn) 機(jī) 體 “鐵 負(fù) 荷 過載 ” (Ironoverload) 與結(jié) 核 分 枝桿 菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)感染宿主后結(jié)核病(Tuberculosis, TB)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。一方面，機(jī)體鐵過載為胞內(nèi) Mtb 生長(zhǎng)繁殖和毒力維持提供充足鐵源，促進(jìn)體內(nèi) Mtb 增殖，加速活動(dòng)性 TB 患者疾病進(jìn)程。TB-HIV 共感染者中， 高血漿鐵蛋白 TB-HIV 共感染者死亡風(fēng)險(xiǎn)是前者的 3 倍。對(duì)比活動(dòng)性 TB 患者、 非活動(dòng)性 TB 患者以及健康人群血清 Fe 相關(guān)水平發(fā)現(xiàn)，TB 的活動(dòng)性與血清 Fe 水平存在顯著的負(fù)相關(guān)。另一方面，鐵過載通過誘導(dǎo)羥基自由基產(chǎn)生，激活巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激或凋亡信號(hào)通路并下調(diào) TB 患者抗 Mtb 防御型 Th1 反應(yīng)，削弱機(jī)體抗 Mtb 保護(hù)性免疫應(yīng)答從而重新激活休眠的 Mtb，促使?jié)摲越Y(jié)核感染的復(fù)燃。

盡管鐵過載對(duì)機(jī)體抗結(jié)核免疫應(yīng)答損傷得到了部分闡明，但鐵過載如何促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi) Mtb 的生長(zhǎng)及其在 TB 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。基于此，鐵過載與抗結(jié)核感染得到了學(xué)者們的日益關(guān)注。由于臨床患者個(gè)體差異大，取材受限，難以深入研究鐵過載與 TB 之間的關(guān)系。本研究擬在利用外源性鐵過載動(dòng)物模型模擬臨床情況，建立鐵過載結(jié)核感染小鼠模型并分析鐵代謝及 Mtb 相關(guān)指標(biāo)，為后續(xù)鐵過載與 TB 發(fā)病機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

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