該模型采用了CRISPR/Cas9技術，創新性地結合了人類遺傳學與動物基因編輯技術，首次在小鼠上重構了與人類疾病類似的遺傳模式，在Tbx6基因上同時引入無效突變和promotor區域的亞效等位基因，并將二者結合，形成復合雜合突變并獲得相應的脊柱畸形表型。該模型是國際上首創的復合雜合突變脊柱畸形表型，對于解釋先天性脊柱側凸的分子機制和發病過程具有極高的研究討論價值。

該基因編輯小鼠將在屏障隔離環境（北京協和醫院實驗動物中心）內進行繁育、飼養及相關實驗，其監督管理措施由動物中心負責。屏障隔離期間將保持清潔，保證其具有SPF級別清潔度，減少感染及發病幾率。嚴格實驗室管理，防止小鼠外泄，實驗設計時將禁止其與野生型小鼠交配，保證編輯基因組序列不向自然界流通。上述措施將保證該動物模型的生物安全性，避免其影響生態環境。

1. Tbx6亞效等位基因的建立。

Tbx6基因調控區域的8個堿基敲除獲得mh等位基因（A），所采用的gRNA在如圖B，luciferase顯示亞效等位基因的轉錄活性（C），in situ顯示Tbx6 mh純合小鼠尾端的Tbx6表達下降（D）。Yang etal., Hum Mol Genet. 2019 Feb 15;28(4):539-547.

2. TACS小鼠的表型評估。

胚胎期E14.5野生型和TACS小鼠的阿爾新蘭染色結果，提示椎體和肋骨的異常（AB）。發生率在不同基因型的小鼠中如C所示。

3. TACS小鼠microCT

成年小鼠的背面和腹側觀，可見半椎體及脊柱側彎的表型，以及部分肋骨融合（AB）。不同基因型的脊柱表型統計在C。

4. 動物模型的評價與驗證

涉及Tbx6基因敲除小鼠的動物模型實驗包括新生小鼠及鼠胚胎的基因型驗證、骨骼染色、骨骼組織的石蠟及冰凍切片染色、microCT掃描等等。評價指標包括脊柱及肋骨的畸形狀態、胚胎骨骼發育情況等等。

1.小鼠基因型鑒定

l 取新生小鼠（P0到P10）鼠耳耳標組織，置于EP管中，加入75ul堿性裂解液并金屬浴95攝氏度加熱15min；

l 冰上冷卻1min，加入75ul中和液獲得DNA原液；

l 按照MasterMix配方制備PCR體系，進行PCR；

l 跑膠，切膠回收目的條帶，提純sanger測序。

2.骨骼染色

l 二氧化碳法處死小鼠，剝離全部皮膚及內臟，小心去除脂肪組織；

l 置于95%乙醇溶液室溫過夜；

l 乙醇更換為100%乙酮室溫過夜，去除多余的脂肪組織，在關節處用針頭戳若干小孔；

l 更換100%乙酮為阿爾欣蘭染液（0.03% in 80% ethanol and 20% glacial acid），根據樣本周齡室溫浸染1-3天；

l 更換染液為0.05%茜素紅染液（1%KOH），根據樣本周齡室溫浸染1-3天；

l KOH脫色透明化1-3天，待軟組織透明化后梯度更換為Glycerol KOH溶液。

3.骨骼組織石蠟切片

l 骨骼組織分離，4%PFA于4攝氏度固定過夜

l PBS洗三遍，進行EtOH脫鈣15天

l 上自動脫水機進行脫水與石蠟預浸潤

l 石蠟包埋，切片

4.骨骼組織冰凍切片

l 骨骼組織分離，4%PFA于4攝氏度固定過夜

l PBS洗三遍，進行EtOH脫鈣15天

l 30%蔗糖溶液脫水，optium預浸潤

l 冰凍包埋，切片

此前研究表明，TBX6無效突變聯合亞效等位基因可解釋約10%漢族人群先天性脊柱側彎的遺傳學發病機制?；诖?，研究團隊設計了Tbx6基因敲除小鼠，試圖在動物模型上再現TACS的表型。 采用CRISPR/Cas9技術，在FVB/NJ小鼠上進行基因編輯。首先，在exon2上加入1bp的堿基插入，造成重要T-box區域的移碼突變，該移碼突變將嚴重影響Tbx6基因的正常功能，模仿人類遺傳學發現的無效突變。研究證實Tbx6純合突變的小鼠胚胎期致死，這與先前的研究一致。隨后，參考人類的亞效等位基因，我們在Tbx6基因的promotor區域進行基因編輯，獲得了Tbx6亞效等位基因（Tbx6 mh），并在luciferase實驗中證實其基因功能約為野生型Tbx6基因的70%。Tbx6mh/mh 和Tbx6+/-交配即獲得TACS小鼠。

一、疾病概述

先天性脊柱側凸（Congenital Scoliosis，CS）指由胚胎期脊柱骨性椎體發育異常引起的脊柱畸形，臨床定義為由椎體結構異常導致的脊柱側方彎曲超過10度。脊柱發育的畸形異常源于母孕期4~6周椎體發育時期，目前認為是一種高頻罕見病，其發病率在活產嬰兒約為1/1000。CS可單獨存在或與一些先天異常導致的器官綜合癥伴發。CS具有進展快、畸形重、并發癥多等特點，嚴重時可致患者癱瘓，是造成青少年殘疾的主要疾病之一，給患者和家庭造成了嚴重負擔。目前臨床治療CS以支具緩解或手術治療為主，缺乏病因學治療手段。

先天性脊柱側凸可按照其畸形類型被分為分節不良型、椎體形成不良型及混合型，其中，單純分節不良或椎體形成不良者約占80%，混合型約占20%。分節不良主要由于上下節段間骨性融合引起，可具有雙側融合（骨塊）、單側融合（骨橋）等特征。椎體形成不良會產生異形椎體，如楔形椎、半椎體、蝴蝶椎等。

CS的致病機制目前尚未完全闡明，國內外已發表的研究工作集中在脊柱發育生物學和人類遺傳學的探索。從發育生物學角度，脊椎動物脊柱的發育主要包括體節形成（somitogenesis）和成骨（osteogenesis）兩個關鍵過程。目前已解釋的CS致病突變集中在影響體節分節和成骨成軟骨過程的基因及相關信號通路，其致病分子機制和臨床干預手段尚待進一步闡明。

北京協和醫院及復旦大學團隊前期研究提示，罕見的TBX6基因突變聯合常見TBX6亞效等位基因可導致以胸腰段半椎體為特征性臨床表型的先天性脊柱畸形，稱TBX6相關先天性脊柱側凸（TBX6-associated congenital scoliosis，TACS）。該遺傳分子診斷分型約可以解釋約10%的漢族人群CS遺傳學病因。TBX6是調控胚胎期中軸骨形成的重要節律基因，前期研究已解釋部分參與脊柱分節的分子機制，且在CS發病人群中的單核苷酸多態性存在變化。TBX6參與CS發生發展過程的具體分子機制尚待進一步解釋。

二、模型背景

1、小鼠信息

FVB/NJ小鼠品系源自遠交系Swiss鼠。1935年，在美國國立衛生研究所NIH飼養，1966年起開始選育，在接種白日咳疫苗后，其中一系HSFS/N對組胺(Histamine)敏感。70年代初，在HSFS/N系第八代發現部份小鼠攜帶Fv1 b基因對B strain Friend白血病毒敏感，后育成Fv1b同型合子近交系，稱FVB。NIH、Jackson等保存。

FVB通用于基因轉殖實驗，有強的繁殖力，產生一窩仔數多，受精卵有大而顯著的前核，易于顯微注射DNA，注射后活力強如C57BL/6 × SJL F1雜交鼠，遠勝于C57BL/6 (Taketo et al., 1991)。

2、實驗動物背景信息

該動物模型在FVB/NJ品系的基礎上，參照人類CS隊列遺傳學信息，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術，構建相應的Tbx6無效突變等位基因和promotor區域突變的亞效等位基因。

3、研究背景

此前研究表明，TBX6無效突變聯合亞效等位基因可解釋約10%漢族人群先天性脊柱側彎的遺傳學發病機制?；诖?，研究團隊設計了Tbx6基因敲除小鼠，試圖在動物模型上再現TACS的表型。