（一）模型評價(jià)方法：

1. 臨床癥狀觀察：

血清中肝功生化指標(biāo)的兩種轉(zhuǎn)氨酶（ALT，AST）是肝損傷的重要標(biāo)志物，GGT的變化除了能表明肝炎急性期和慢性期的情況，同時(shí)對于肝臟腫瘤也具有一定的指示作用。這些指標(biāo)可通過常規(guī)血清檢測得到數(shù)據(jù)。

2. 病毒載量測定方法：

（1）WHV病毒DNA的提取：

血清樣本處理：用促凝采血管收集的血樣，室溫放置30min后，3000rpm室溫離心10min，得到上層血清放入離心管中備用；組織樣本處理：檢測WHV病毒載量主要組織樣本為肝臟，分別在每個(gè)肝葉取約50mg樣本，用生理鹽水漂洗后，加入到含蛋白酶K的DNA裂解液中，裂解16h至組織破碎完全。使用DNA提取試劑盒提取病毒DNA，最后用30μl水溶解DNA。短期保存可存放于4℃冰箱，若需長期保存需存放于-20℃冰箱。

（2）WHV病毒載量的測定：實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：DNA樣品制備：待測樣本：待檢測的感染W(wǎng)HV病毒的土撥鼠血清，按照5.2.1所用方法提取WHV病毒DNA；標(biāo)準(zhǔn)品：已知濃度的WHV-DNA質(zhì)粒，按照109、108、107、106、105、104、103copies/μl進(jìn)行稀釋；空白對照：分子級無菌蒸餾水 (無RNA酶和DNA酶)；陰性對照：未感染W(wǎng)HV病毒的土撥鼠血清；

實(shí)驗(yàn)步驟：（a）每個(gè)待檢測樣本反應(yīng)液的組成為：

2×SYBRAdvantage qPCR Premix 10 ul primer-forward（20μM）1 ul primer-reverse（40μM）1 ul TemplateDNA 2 ul Total 20 ul

WHVprimer: Forward primer 5'-TCTCCTGGACTGGAAAGGTT-3'

Reverseprimer5'-ATTGAGCCAAGAGAAACGGG-3'

（b）擴(kuò)增條件設(shè)定：

（3）儀器檢測通道選擇：

使用ABIStepOne Plus熒光PCR檢測儀時(shí)選擇SYBR Green熒光信號，收集設(shè)在58℃。具體設(shè)置方法請參照各儀器使用說明書。

（4）結(jié)果分析閾值設(shè)定：

使用ABIStepOne Plus熒光PCR檢測儀進(jìn)行結(jié)果分析，基線和閾值設(shè)定根據(jù)儀器噪音情況調(diào)整。

（5） 熒光定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)的質(zhì)量控制：

a. 反應(yīng)結(jié)果應(yīng)同時(shí)符合以下條件，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效。

陰性對照：無擴(kuò)增，為陰性。

標(biāo)準(zhǔn)品：CT值＜28

否則結(jié)果無效。

b. 結(jié)果判斷：

陰性：無CT值或CT值大于38

陽性：CT值＜38，可報(bào)告為陽性。

CT值大于38的樣本建議重做，若重做結(jié)果CT值＜38，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。

陽性樣本具體載量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

圖5. 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線

3. 病理分析：HE染色

組織樣本經(jīng)固定、包埋、切片處理后，可通過H&E染色觀察感染動物組織內(nèi)的損傷情況和炎性細(xì)胞的浸潤狀況。具體步驟如下：

用10%福爾馬林固定72h，在24h內(nèi)可換液一次；將固定的組織修塊后脫水、透蠟用石蠟包埋；隨后石蠟塊進(jìn)行切片；石蠟切片脫蠟后，進(jìn)行蘇木精染色；切片繼續(xù)脫水后染伊紅；最后進(jìn)行透明、封片，得到HE病理切片，可進(jìn)行鏡檢。標(biāo)本切片可長期保存。

（二）評價(jià)指標(biāo)：

1. 臨床癥狀評價(jià)：

由于免疫系統(tǒng)未發(fā)育完全，新生土撥鼠感染W(wǎng)HV病毒后，有60%-70%的概率發(fā)展成慢性感染。在感染急性期，肝功生化指標(biāo)（ALT和AST）都有升高，表現(xiàn)出肝臟損傷；而長期的病毒復(fù)制導(dǎo)致慢性肝炎，期間雖然血液中檢測的病毒載量會有波動，但肝部損傷加劇，且肝臟炎癥和腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)升高。

2. 病毒復(fù)制情況評價(jià)體系：

在急性感染期，WHV病毒在血液中的水平在感染后5-6個(gè)月達(dá)到峰值，平均載量約為107copies/ml。此后由于機(jī)體無法清除病毒，WHV在肝臟中長期復(fù)制，在血液中能持續(xù)檢測到病毒核酸，病毒在血液中的水平大部分時(shí)間維持在104copies/ml。

3. 病理評價(jià)體系：

WHV病毒感染土撥鼠，在慢性期肝臟病理發(fā)生顯著變化，可觀察到慢性炎癥表型，包括：肝竇擴(kuò)張，大量炎細(xì)胞彌漫浸潤等。

WHV病毒具有種屬特異性，只感染土撥鼠，不感染人和其他實(shí)驗(yàn)動物；且未出現(xiàn)在《人間傳染的病原微生物名錄》中。動物感染病毒和飼養(yǎng)都可在普通環(huán)境中進(jìn)行，但需跟土撥鼠繁殖區(qū)分開。WHV病毒已經(jīng)過風(fēng)險(xiǎn)評估，具有相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序。模型實(shí)驗(yàn)已得到IACUC批準(zhǔn)，獲得實(shí)驗(yàn)資質(zhì)。

WHV病毒只對土撥鼠敏感，并不感染人、以及小鼠大鼠等常用的實(shí)驗(yàn)動物；在土撥鼠種群中常為垂直感染模式，實(shí)驗(yàn)室中采用的為血液感染模式。為預(yù)防對其他土撥鼠的影響，實(shí)驗(yàn)人員均需經(jīng)過生物安全培訓(xùn)獲得證書，具有生物安全操作資質(zhì)；進(jìn)入動物房之前，穿戴防護(hù)服、口罩、帽子、鞋套等進(jìn)行防護(hù)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后按要求去除防護(hù)設(shè)備集中處理。盡量避免進(jìn)入感染動物區(qū)后再進(jìn)入繁殖區(qū)，若需進(jìn)入則應(yīng)更換整套個(gè)人防護(hù)設(shè)備。

由于感染W(wǎng)HV土撥鼠血液中可能存在著大量病毒，因此對于采血后的耗材、以及沾染到血液的墊料等，都需要進(jìn)行高壓滅菌處理，以消除正常土撥鼠的潛在感染源。動物感染病毒后取得的血液和組織直接放入核酸裂解液或組織固定液，滅活病毒。所有涉及到的相關(guān)污染物如離心管、灌胃針、手術(shù)剪、手術(shù)鑷和毒株等將統(tǒng)一高溫高壓消毒后集中處理。

動物實(shí)驗(yàn)操作均在ABSL-2動物房的生物安全柜中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)后將病毒毒株、動物尸體、尿墊等包裝好進(jìn)行高壓滅菌處理，注射器放入利器桶處理。

1. 急性期肝炎

土撥鼠感染W(wǎng)HV后第8周，血清中病毒載量達(dá)到最高峰（106拷貝/ml，圖1），血清中WHsAg濃度與病毒載量相對應(yīng)，在感染后8周達(dá)到最高值（圖2A），感染后血清中WHcAb自第2周開始檢出，且濃度不斷升高，低劑量組的WHcAb濃度在第8周達(dá)到最高峰，而高劑量組則持續(xù)增高（圖2B）。在此期間，土撥鼠的肝功酶活性維持在較高水平：ALT和AST分別達(dá)到正常值的4～8倍和3～4倍（圖3）。自感染后至16周，病毒復(fù)制、血清學(xué)指標(biāo)和肝功能均處于較高水平，表明WHV感染的土撥鼠在此階段處于急性肝炎期。急性肝炎期的病理表現(xiàn)為：匯管區(qū)肝細(xì)胞出現(xiàn)點(diǎn)灶狀肝細(xì)胞壞死伴炎細(xì)胞浸潤及散在出血（圖4A、4B），免疫組化染色顯示肝細(xì)胞胞漿出現(xiàn)大量的WHsAg染色顆粒 (圖4C、4D)。

圖1土撥鼠血清中病毒載量（lg 拷貝/ml）

2. 土撥鼠肝炎病毒感染后急性期向慢性期的轉(zhuǎn)變

感染后16周至24周，低劑量組土撥鼠血清中病毒DNA逐漸降低并消失（圖1），與此相對應(yīng)，其血清中WHsAg也漸趨于消失（圖2A），而WHcAb則維持在較低水平（圖2B）。同時(shí)，低劑量組土撥鼠的肝功酶ALT和AST也逐漸降低到感染前水平（圖3），這些結(jié)果表明：低劑量組感染土撥鼠已由急性感染轉(zhuǎn)為自愈。與低劑量組相反，高劑量組土撥鼠血清中病毒載量一直處于較高水平，截止到檢測之日（第24周），病毒DNA拷貝數(shù)一直維持在105拷貝/ml左右（圖1）。與急性期相比，血清中WHsAg濃度略有下降（圖2A），但WHcAb濃度則不斷增高（圖2B），同時(shí)，肝功酶ALT和AST的水平呈下降趨勢，但仍為正常值的1倍左右（圖3）。該結(jié)果表明：高劑量組土撥鼠仍維持低水平感染，提示向慢性肝炎的轉(zhuǎn)變。

圖2A 土撥鼠血清中表面抗原檢測 (OD450)

圖2B土撥鼠血清中核心抗體檢測結(jié)果(OD450)

圖3A 土撥鼠血清肝功酶AST檢測結(jié)果（U/L）

圖3B 土撥鼠血清肝功酶ALT檢測結(jié)果（U/L）

圖4 低劑量組16周肝臟病理變化。注：A、C為對照組肝臟HE染色和免疫組化WHsAg染色結(jié)果。B 為低劑量組感染后第16周肝臟組織HE染色，D為WHsAg免疫組化染色

1. 病毒制備

WHV為cWHV7P1毒株（NCBI存儲號:M18752.1），來自美國喬治敦大學(xué)微生物與免疫室，采集來自慢性感染土撥鼠的血清，病毒儲存液濃度為1×1010 拷貝/ml。

2. 動物

7日齡-1月齡土撥鼠。實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行血清病毒W(wǎng)HV DNA 的PCR檢查，陰性土撥鼠方可入組。

3. 感染實(shí)驗(yàn)

動物經(jīng)獸用氯胺酮麻醉后，經(jīng)頸外靜脈注射WHV，感染劑量分別為5×106 WID50（低劑量）和1×107 WID50（高劑量），感染體積為100 μl，病毒儲存液用生理鹽水稀釋，對照組土撥鼠注射等體積的生理鹽水，感染后的土撥鼠隔離飼養(yǎng)。在感染后不同時(shí)間點(diǎn)，動物經(jīng)獸用氯胺酮麻醉后，心臟取血，離心分離血清。

4. 血清檢測

感染后血清標(biāo)志物檢測：土撥鼠肝炎病毒表面抗原（WHsAg）和核心抗原（WHcAg）經(jīng)過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，經(jīng)鎳離子親和層析純化。WHsAg分別免疫兔和雞后獲得兔抗WHsAg抗體和雞抗WHsAg抗體。通過ELISA雙抗夾心法檢測WHsAg，ELISA直接法檢測WHcAb。

5. 核酸檢測

使用DNA提取試劑盒QIAamp MinEluteVirus Spin Kit從50μl血清中抽提 WHV DNA。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定血清中WHV DNA拷貝數(shù)，引物為WHVSF1\WHVSR1(5’-GGCAACAACATAAAAGTCAC-3’\5’-AACTAAACCACGTGGTATGTC-3’)，梯度稀釋的WHV DNA質(zhì)粒做標(biāo)準(zhǔn)品。

5. 肝功能檢測

取血樣檢測感染后土撥鼠肝功能酶：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)。

6. 病理診斷

甲醛固定的土撥鼠肝臟組織經(jīng)石蠟包埋，常規(guī)病理組織切片處理后，HE染色，顯微鏡下觀察病理改變。

7. 免疫組化

肝臟病變組織經(jīng)過組織修塊，石蠟包埋后，切片厚度為4μm，經(jīng)脫蠟水化，抗原修復(fù)，滴加20%正常山羊抗血清室溫封閉后，滴加兔抗WHsAg抗體，稀釋比例1:500,4度過夜。次日PBS洗滌，滴加熒光標(biāo)記二抗，稀釋比例1:5 000，PBS洗滌后，DAB顯色，脫水封片，鏡下觀察。

人乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitisB virus, HBV）感染引起的傳染病，至少有20億人曾經(jīng)被乙肝病毒感染。HBV是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科，據(jù)目前所知，HBV只對人和猩猩有易感性。HBV在肝內(nèi)繁殖復(fù)制，但是對肝細(xì)胞無明顯的直接損傷作用，但會引發(fā)免疫系統(tǒng)攻擊感染HBV的肝細(xì)胞，形成慢性肝炎，繼而發(fā)展為肝纖維化，是引發(fā)肝癌的重要因素。

目前，由于HBV疫苗的使用，使HBV感染率顯著降低，但慢性乙肝存在較大的轉(zhuǎn)為肝癌的風(fēng)險(xiǎn)。由于缺乏理想的乙肝動物模型，限制了針對乙肝病程發(fā)展和干預(yù)治療策略的研究進(jìn)展。

1978年，薩默斯(Summers)等發(fā)現(xiàn)費(fèi)城動物園的土撥鼠感染土撥鼠肝炎病毒（Woodchuck HepatitisVirus，WHV）。WHV與HBV在形態(tài)學(xué)、基因結(jié)構(gòu)、基因產(chǎn)物、復(fù)制過程、流行病學(xué)及疾病和肝癌的發(fā)展上有很高的相似性，WHV可引起急性自限性感染和慢性感染，其發(fā)病機(jī)理及免疫反應(yīng)機(jī)制和HBV類似。WHV感染成年土撥鼠會導(dǎo)致急性自限性肝炎，而感染新生土撥鼠會發(fā)展為慢性肝炎，慢性肝炎易發(fā)展為肝細(xì)胞癌（HCC），土撥鼠模型的疾病發(fā)展特征使其成為研究慢性乙型肝炎向終末期肝病轉(zhuǎn)化的理想動物模型。