為了研究Npsn在斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞中的功能，我們運(yùn)用CRISPER/Cas9技術(shù)對(duì)斑馬魚(yú)npsn進(jìn)行全基因組敲除，并且獲得了一系列npsn基因發(fā)生移碼突變的突變體斑馬魚(yú)，比如在exon5-Cas9靶點(diǎn)獲得的（-7，+0）（npsnsmu5）突變體，和在exon6-Cas9靶點(diǎn)處獲得的（-0，+1）（npsnsmu6）突變體，并且經(jīng)預(yù)測(cè)它們的蛋白結(jié)構(gòu)相對(duì)于野生型斑馬魚(yú)出現(xiàn)移碼突變和提前終止。但是我們通過(guò)WISH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在npsnsmu5突變體斑馬魚(yú)中，npsn的信號(hào)幾乎是缺失的，并且qRT-PCR結(jié)果也同樣證明了在npsnsmu5突變體中npsn的mRNA水平下降到野生型斑馬魚(yú)的5%左右，可能是由npsn的無(wú)義突變導(dǎo)致了mRNA的全面降解所導(dǎo)致的。但是npsnsmu5純合突變體胚胎能夠正常存活到成年，大小和體型正常，并且是可以正常的產(chǎn)生后代。

為了研究Npsn缺陷是否影響斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞的發(fā)育，我們通過(guò)斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞特異性標(biāo)記基因mpx和lyz的整體原位雜交，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體和野生型斑馬對(duì)比，mpx+和lyz+信號(hào)點(diǎn)的數(shù)量沒(méi)有明顯差別。蘇丹黑染色也同樣發(fā)現(xiàn)SB+陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量也沒(méi)有差異。并且進(jìn)一步在DIC下觀察npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞中的顆粒，也未發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。以上結(jié)果表明，Npsn缺陷并不顯著影響斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞的發(fā)育和數(shù)量。這可能是因?yàn)镹psn只是斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞中的一種酶顆粒，缺失后并不影響中性粒細(xì)胞的發(fā)育，但是可能影響了中性粒細(xì)胞的某些功能。

為了研究Npsn缺陷對(duì)斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞功能的影響，而中性粒細(xì)胞的主要功能是參與機(jī)體的固有免疫反應(yīng)，因此我們做了斑馬魚(yú)大腸桿菌的侵染實(shí)驗(yàn)。我們利用顯微注射的方式感染npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚(yú)胚胎的卵黃囊，通過(guò)記錄并比較感染后兩者的生存率，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體在感染大腸桿菌后生存率相對(duì)于野生型胚胎顯著下降，體內(nèi)殘余的菌量明顯上升，并且在感染的早期階段，npsnsmu5突變體中炎性因子的表達(dá)水平比野生型明顯升高，這說(shuō)明了中性粒細(xì)胞在抵抗細(xì)菌感染中存在功能缺陷。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Npsn在中性粒細(xì)胞抵抗感染中的作用，我們通過(guò)構(gòu)建斑馬魚(yú)Npsn過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同時(shí)感染大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)Npsn過(guò)表達(dá)后能顯著提高感染后斑馬魚(yú)的存活率。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步表明，斑馬魚(yú)Npsn有助于斑馬魚(yú)抵抗細(xì)菌感染。

但是Npsn通過(guò)哪種方式來(lái)幫助中性粒細(xì)胞抵抗感染的呢？先前有體外實(shí)驗(yàn)證明，鯉魚(yú)的Npsn能夠水解纖連蛋白和明膠，而這兩種組分又是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，那么Npsn是否通過(guò)影響斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞的遷移來(lái)影響對(duì)大腸桿菌的抵抗的呢？為了驗(yàn)證這個(gè)觀點(diǎn)，我們觀察了在感染后4小時(shí)時(shí)傷口處中性粒細(xì)胞的數(shù)量，但是比較npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚(yú)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯差異。另外，Npsn作為一種水解酶，它能否能夠直接水解和破壞大腸桿菌細(xì)胞的完整性，進(jìn)而影響大腸桿菌在機(jī)體內(nèi)存活的呢？并且Npsn缺陷主要影響斑馬魚(yú)清除哪種類(lèi)型的菌呢？為了驗(yàn)證這些問(wèn)題，我們也將npsnsmu5突變體斑馬魚(yú)和野生型斑馬魚(yú)同時(shí)感染了其他類(lèi)型的菌，如革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌等，發(fā)現(xiàn)Npsn缺陷后可能增加斑馬魚(yú)對(duì)革蘭氏陰性菌的敏感性。但是Npsn影響斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞抵抗細(xì)菌感染的具體機(jī)制，還需要更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。另外npsnsmu5突變體可以作為斑馬魚(yú)免疫與炎癥反應(yīng)模型，對(duì)研究在感染過(guò)程中，中性粒細(xì)胞與病原菌的相互關(guān)系，以及對(duì)研發(fā)新的抗菌藥物具有重要的指導(dǎo)意義。

動(dòng)物模型的制備和應(yīng)用實(shí)驗(yàn)必須在具備相應(yīng)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。動(dòng)物模型的制備、應(yīng)用過(guò)程中的監(jiān)督管理、處置措施、對(duì)環(huán)境和生態(tài)影響等應(yīng)符合國(guó)家相關(guān)法律規(guī)定。

1、模型的形態(tài)特征

患病小鼠四肢的腳趾、腳掌以及踝部關(guān)節(jié)會(huì)出現(xiàn)紅腫，嚴(yán)重則關(guān)節(jié)僵直，行動(dòng)受阻。如圖1所示。

圖1：模型組小鼠發(fā)病后與對(duì)照組小鼠的足部狀態(tài)對(duì)比。（A）、（C）模型組小鼠腳趾、腳掌、踝部關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫。（B）、（D）對(duì)照組小鼠不發(fā)病，足部狀態(tài)正常。

對(duì)小鼠的發(fā)病情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，如圖2所示。模型組小鼠在第3天發(fā)病，病情在第9~10天達(dá)到一個(gè)高峰狀態(tài)；第10~11天可選擇性地再次注射25~50μg LPS，延長(zhǎng)發(fā)病周期，病情加重，在第14~15天以后病情逐漸緩解。若不進(jìn)行二次注射，炎癥癥狀則從第11天開(kāi)始逐漸下調(diào)。

圖2中（A）顯示模型組小鼠在第8天發(fā)病率達(dá)到100%，對(duì)照組全部不發(fā)病，故在圖中不予顯示。（B）顯示模型組小鼠四肢發(fā)病數(shù)平均在3~4肢，在第12天病情達(dá)到最高峰，對(duì)照組不發(fā)病。（C）為對(duì)關(guān)節(jié)炎發(fā)病程度的評(píng)價(jià)，測(cè)量小鼠的踝部關(guān)節(jié)以及腳掌腫脹厚度，根據(jù)病情嚴(yán)重程度為其打分：足部無(wú)紅腫，不發(fā)病——0分；1~2個(gè)腳趾紅腫，或有輕微的紅腫或紅斑——1分，3~5個(gè)腳趾紅腫或足部有較明顯的紅腫——2分；整個(gè)足部嚴(yán)重紅腫，關(guān)節(jié)僵直——3分；每只動(dòng)物最高分?jǐn)?shù)為12分。對(duì)照組不發(fā)病故全部分?jǐn)?shù)為0。

圖2：統(tǒng)計(jì)小鼠足部發(fā)病情況。（A）發(fā)病率（B）四肢發(fā)病的數(shù)量（C）病情評(píng)價(jià)打分

2、模型的病理特點(diǎn)

（1）組織切片染色進(jìn)行病理學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第18~19天，處死動(dòng)物收集樣本。取小鼠四肢（主要為足部部分）浸沒(méi)于10%中性福爾馬林中進(jìn)行固定，隨后經(jīng)甲酸脫鈣后，石蠟包埋，切片，蘇木素伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察。

如圖2顯示，（A）、（C）為模型組小鼠樣本，表現(xiàn)為軟骨受侵蝕，關(guān)節(jié)囊纖維組織增生，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，骨質(zhì)受破壞，滑膜細(xì)胞脫落，腔內(nèi)積液等。（B）、（D）為對(duì)照組，其軟骨面完整平滑，無(wú)增生與積液現(xiàn)象，表現(xiàn)正常。

圖3：小鼠足部樣本HE染色。（A）模型組：軟骨侵蝕，關(guān)節(jié)囊纖維組織增生，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，骨質(zhì)破壞。（C）模型組：軟骨面破壞，滑膜細(xì)胞脫落，有積液。（B、D）對(duì)照組：正常。

（2）CT檢測(cè)骨骼損傷情況

將經(jīng)10%中性福爾馬林固定后的小鼠足部樣本進(jìn)行CT掃描拍片，觀察其足部的骨骼損傷情況。如圖4所示，（A）、（C）圖中為模型組小鼠骨骼，骨骼表面不平整，扭曲變形，新生骨與破骨并存，骨骼損傷嚴(yán)重。（B）、（D）為對(duì)照組，骨骼表面與腔內(nèi)平滑，正常無(wú)損傷。

圖4：小鼠足部樣本CT。（A）模型組表面俯視圖（B）對(duì)照組表面俯視圖（C）模型組截面圖（D）對(duì)照組截面圖

（3）模型組織中細(xì)胞因子表達(dá)情況的分析

檢測(cè)小鼠關(guān)節(jié)與血液中幾種主要的促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)情況，如圖5所示。其中IL-6、IL-17、TNF-α都是在炎癥反應(yīng)中起重要作用的促炎性細(xì)胞因子。IL-6對(duì)破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨質(zhì)吸收、滑膜炎等炎癥進(jìn)程起關(guān)鍵作用，也是機(jī)體炎癥反應(yīng)的標(biāo)志性細(xì)胞因子。IL-17是一種主要由活化T細(xì)胞產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子，在T細(xì)胞介導(dǎo)的滑膜炎、骨破壞等過(guò)程起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，是關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中最標(biāo)志性的調(diào)節(jié)因子之一。TNF-α能夠促進(jìn)粘附分子和蛋白酶表達(dá)，在骨破壞以及滑膜細(xì)胞增生等過(guò)程中起重要作用[3]。因此，這些促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平反應(yīng)了病情的嚴(yán)重程度。

取得小鼠關(guān)節(jié)樣本，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，通過(guò)Real-Time PCR檢測(cè)關(guān)節(jié)中促炎性因子的相對(duì)表達(dá)量；提取小鼠血清，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，檢測(cè)血清中促炎性因子的表達(dá)量。雖然在取樣時(shí)間段（第18~19天）炎癥反應(yīng)正逐漸下調(diào)，關(guān)節(jié)與血清中的IL-6、IL-17、TNF-α的表達(dá)量仍然高于正常水平。

圖5：（A）關(guān)節(jié)中炎癥因子的相對(duì)表達(dá)量（B）血清中炎癥因子的表達(dá)水平

1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J小鼠，屬動(dòng)物界、脊索動(dòng)物門(mén)、哺乳綱、嚙齒目、鼠科、小家鼠種（Mus musculus），1921年Abby Lathrop得到動(dòng)物后開(kāi)始近親交配，育成數(shù)個(gè)近交系。本實(shí)驗(yàn)中于SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)。

2、模型構(gòu)建

使用8~9周齡的C57BL/6J雌性小鼠，分為兩組，每組各6~7只。

關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)試劑為Chondrex公司生產(chǎn)的Arthrogen-CIA?ArthritogenicMonoclonal Antibody試劑盒。

對(duì)于模型組小鼠，每只腹腔注射5mg膠原抗體混合物，記為第0天，第3天時(shí)腹腔注射25~50μg LPS，能夠快速誘導(dǎo)發(fā)病；第10~11天可選擇性地再次注射25~50μg LPS，使加重病情，延長(zhǎng)發(fā)病周期，繼續(xù)觀察。對(duì)照組在同樣的時(shí)間腹腔注射等體積的PBS。

一、疾病概況

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種以滑膜持續(xù)炎癥和關(guān)節(jié)軟骨及骨破壞為特征的慢性進(jìn)行性的自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜炎及對(duì)稱(chēng)性、破壞性的關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕卣鳌A在我國(guó)的發(fā)病率為0. 26%~0. 5%，能夠發(fā)生于任何年齡，女性發(fā)病多于男性[1]。RA炎癥反應(yīng)造成患者機(jī)體肉芽組織和纖維增生，使得關(guān)節(jié)腔內(nèi)的血供嚴(yán)重受損；嚴(yán)重的缺血使得局部出現(xiàn)壞死，以累及周?chē)P(guān)節(jié)為主，故其基本病理改變?yōu)榛ぱ譡2]。主要臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫痛，繼而軟骨破壞、關(guān)節(jié)間隙變窄，晚期因嚴(yán)重骨質(zhì)破壞、吸收導(dǎo)致關(guān)節(jié)僵直、畸形、功能障礙。

該疾病為一種反復(fù)發(fā)作性疾病，致殘率較高，預(yù)后不良，目前還沒(méi)有很好的根治方法。

二、發(fā)病機(jī)制

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病的主要因素有：（1）B細(xì)胞的介導(dǎo)作用與自身抗體的產(chǎn)生；（2）T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的介導(dǎo)作用與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)；（3）遺傳因素。但就目前來(lái)講，RA的病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，其可能與具有某些遺傳特征的人群對(duì)一些抗原刺激具有敏感性而引發(fā)的免疫應(yīng)答反應(yīng)所導(dǎo)致的病理性改變有關(guān)。免疫調(diào)節(jié)機(jī)制、功能障礙是導(dǎo)致RA的主要機(jī)制，在RA患者的滑膜組織中出現(xiàn)異常增多的T、B淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞介素、趨化因子、干擾素等細(xì)胞因子以及自身抗體等均提示這些物質(zhì)有可能參與RA的發(fā)生和發(fā)展[1]。